細胞培養基的基本知識

細胞培養基的基本知識
培養細胞的*培養基由基礎培養基（如MEM）和添加劑（如血清或無血清培養用的某些確定的激素及生長因子）組成，培養基的配方一直在改進，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
一、基礎培養基 絕大多數培養基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養物質。zui廣泛應用的培養基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規含有無機鹽和代謝添加劑（例如核苷酸）。MEM/F12 這兩種培養基各取1/2，形成神經生物學zui通用的培養基。Dulbecco`s改良培養基——DMEM，現應用于快速生長的細胞，同MEM含有相同的營養成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養基，應仔細了解成分表，應知道大多數情形下培養基都有不足。例如，有些培養基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養基雖廣泛用于神經生物學領域，但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經元而言，則并非*選擇，特別是如果神經元生長在缺乏膠質的環境中時。F12中含有硫酸亞鐵，據報道也有神經毒效應。
在所有這些培養基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩定性以及在許多細胞培養中它常用作碳源。對于神經元的培養常常在基礎培養基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培養基中這兩種物質缺乏時）。MEM與F12均要用5%的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養基的組成成分是建立在對不同細胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養中使用也能有比較令人滿意的結果。 原則上，HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養環境的限制。實際操作中并非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養基可用來在大氣環境中令神經細胞生長，該培養基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產生。這一培養基的優點是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時，例如在長時間的顯微操作及生理學研究中。L15培養基已用來成功的培養了外周神經元，但尚未在CNS神經元的發育研究中全面檢測過。
二、血清 細胞在單純的基礎培養基中不能存活，在特殊類型的細胞培養中必須提供某些痕量營養物質及生長因子才能使細胞得以生長并維持生長狀態。基礎培養基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經驗確定，廣泛應用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用于細胞系和原代培養。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經元培養。然而，很多人也將胎牛血清用于神經元培養，也有人用馬血清來培養膠質細胞。用大鼠進行神經元培養的某些研究者喜歡使用同型血清；人類的胎盤血清，亦曾用于神經組織的器官類型的培養，也用在一些特殊培養種類中。 血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發現，應該在使用前對血清進行測試。大多數試劑商提供樣品，所滿意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。
三、無血清培養基 1979年神經細胞培養出現了一個重要進展，用化學添加劑即可維持神經細胞存活與生長而不需要在培養基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營養物和促貼壁的物質的組合置換培養基中的成分，zui后找到了適合大多數細胞培養的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經細胞培養，zui早是用在B104大鼠神經母細胞瘤細胞系的培養。它的基礎培養基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對于大多數類型細胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報道說還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。 未料到的是上述配方構成的培養基可以支持神經母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發展了能支持原代培養的各種神經元生長的培養基，這種培養基在許多實驗室里已取代了有血清培養。在某些培養方案中，細胞直接進入無血清培養，這樣的培養基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測生長因子以及其他促進神經元存活或生長的因子，或者用來檢測那些可保護神經元免遭環境毒物損傷的制劑。于神經元的培養基在某些培養環境中還可以減低非神經元細胞的增殖，故可使神經元純化。 血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養基中。當缺乏這些成分時，如神經元在無血清培養基中生長時，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養基中過氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進低密度培養細胞的存活。有學者發現細胞存活可為氧分壓的下降而促進。因而，無血清培養基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養時變小，特別是神經元與膠質共培養時，它們可以吸收和代謝神經元毒性物質如谷氨酸。 應該注意，盡管無血清培養基是有化學限定性的，但在培養過程中它仍有變動，培養起始時可能有些物質缺乏，而后細胞的產物可能積累，從而使培養基的成分改變。這其實是有另一方面的好處，即條件培養基（已培養過細胞的培養基）的形成，條件培養基常常用來增加神經元和膠質細胞的發育。