三聚氰胺ELISA檢測試劑盒說明書

　1.概述
　　此試劑盒的原理是酶聯免疫測定法，這個試劑盒可用于一切樣品中三聚氰胺的定性或定量檢測。如果需要進一步測定可以利用HPLC,GC/MS技術。
　　2.安全指導
　　試劑盒標準中含有少量的三聚氰胺，另外，底物溶液中含有四甲基聯苯胺，終止液里含有稀釋的鹽酸。盡量避免不要和這些試劑接觸，如果這些試劑接觸到皮膚請馬上用水沖洗。
　　3.存儲和穩定性
　　試劑盒應在4–8℃保存，在使用前試劑盒內的所有試劑都要回溫到室溫(20-25℃)在有效期內試劑可以一直使用
　　4.原理
　　酶聯免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。將標準、樣品提取物和三聚氰胺酶標記物加入到已經包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉微孔中所有沒有結合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用稀釋的洗液清洗結束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結合的酶標記物將無色的底物轉化為藍色的物質。孵育20分鐘后停止此反應，根據各孔顏色深淺進行數據讀取。依據標準的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。
　　5.局限性
　　我們已經對可能出現在檢測樣品中的很多有機和無機物做了檢測，發現它們不和這個試劑盒發生交叉反應。然而在樣品中也有一些易變質的化合物，它們通過基質影響來干擾測定，如含脂肪的食品，它們在測定前要通過稀釋來消除一些基質影響。在使用的過程中出現失誤也會影響結果，例如試劑盒存儲的條件、吸取液體的程序、吸取液體的不準確、在發生免疫和底物反應的過程中孵育時間不準確。
　　6.工作數據
　　敏感性：三聚氰胺檢測限10μg/L，B/B0為50%時的值為150 μg/L，測定結果在標準曲線的中間是zui的。
　　重復性：
　　標準的變異系數(CVs) <10%;樣品的變異系數(CVs)<15%.
　　特異性：
　　A 試劑盒組成
　　1、真空包裝微孔板(8×12條)，包被有三聚氰胺多克隆抗體
　　2、6瓶三聚氰胺標準液，濃度分別為0、20、50、100、200、500ng/mL(ppb)
　　3、1瓶7mL 三聚氰胺酶標記物
　　4、5×濃縮洗液 100ml ;使用前需要使用蒸餾水以1：5的比例稀釋
　　5、1瓶14mL底物(TMB)
　　6、1 瓶14mL終止液.(注意:鹽酸,勿接觸皮膚!).
　　B 測試前準備
　　微量移液器" target="_blank">微量移液器和吸頭是必須使用的，推薦使用排槍，在做同一次測試時要使用同一個盒子里的試劑和標準。
　　1、使用前將所有的試劑拿到室溫(19℃-25℃)。
　　2、從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。
　　3、標準液，酶結合物，底物，終止液不用稀釋直接使用。
　　4、洗液在使用前要以1：5的比例稀釋后使用(比如：10ml洗液+40ml的蒸餾水)。
　　5、由于終止液中包含鹽酸拿的時候要小心。
　　C. 步驟
　　1、在對應的微孔中加入100 μL 標準或樣品。做重復。
　　2、用排槍在每個孔中都加入50μL酶標記物、然后用紙片蓋住微孔，輕輕震蕩微孔板30秒使孔中的液體混勻。
　　3、在室溫下孵育30分。
　　4、將孔里的液體倒入合適的容器中，每個微孔至少加入250μL、1×洗液，然后棄掉洗液到合適的容器中，重復洗3次。在一層厚的吸水紙上拍板，去掉殘留的洗液。
　　5、使用排槍在每個孔中加入100μL底物顯色液，在室溫孵育20分。盡量使其不見光。
　　6、每孔加入100μL終止液，板中顏色將會由藍色變為棕黃色。
　　7、450nm 下讀取每個孔的吸光度值(OD)。
　　D. 結果評估
　　可以利用商業ELISA軟件程序比如Logit/Log or 4-Parameter來評價ELISA結果。也可以通過計算每個標準的%B/B0值，以%B/B0為y軸、三聚氰胺濃度為x軸作一標準曲線。樣品濃度可以通過標準曲線來計算。當樣品中的三聚氰胺濃度高于標準5(500μg/L)時，需要稀釋后重新再測定來獲得更的結果。
　　半定量結果的判定，可根據樣品的吸光度值與標準的吸光度值來判定，樣品的吸光度值低于某個標準的吸光度值，則說明樣品的三聚氰胺含量大于此標準的濃度，樣品的吸光度值高于某個標準的吸光度值，則說明樣品的三聚氰胺含量小于此標準的濃度。
　　E.還需設備
　　1、50μL ～200μL 單道或多道移液器和吸頭
　　2、微孔板洗滌機
　　3、振蕩器
　　4、蒸餾水或去離子水
　　5、吸水紙
　　6、離心機
　　7、450nm 濾光片的酶標儀